表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，是兒茶素中含量最高活性最強的成分，也是綠茶利好人體健康的主要承擔者。兒茶素的結構特征是B-環(huán)上有二個(gè)或三個(gè)羥基基團和A-環(huán)上的5，7-二羥基基團，因此具有抗氧化活性。EGCG除上述兩個(gè)環(huán)上的羥基外，還在D-環(huán)上帶有三個(gè)羥基，在四種主要的兒茶素中，其抗氧化活性最強。EGCG不僅可以直接清除胞內活性氧/氮離子，還能螯合幾種具有強正電荷的金屬離子；其可使鐵離子失活，抑制超氧化物驅動(dòng)的芬頓反應；抑制H₂O₂形成和脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，大多研究認為EGCG對人體健康的利好效應源于其卓越的抗氧化能力。

然而，由于EGCG特殊的化學(xué)結構特征，穩定性較差，可發(fā)生自動(dòng)氧化和異構反應，根據所處條件(EGCG濃度、pH、溫度和含氧景等)其反應取向不同。當EGCG自動(dòng)氧化形成多聚物時(shí)，可能產(chǎn)生如H₂O₂一類(lèi)的活性氧，表現出促氧化活性。有研究發(fā)現，50μmol/LEGCG在無(wú)細胞的McCoy’S5A培養基中120min，培養基中的H₂O₂達到峰值25μmol/L。用相同的條件處理HT-29細胞30min后培養體系中的H₂O₂水平達到最高水平10μmol/L，在活體中，也觀(guān)察到了EGCG的促氧化效應，用高劑量的EGCG喂食小鼠，出現劑量依賴(lài)的肝臟毒性。但EGCG的促氧化效應在不同的細胞和動(dòng)物模型中并沒(méi)有得到一致的結論。Sheng等發(fā)現200μmolZL的H202能顯著(zhù)誘導正常人心臟成肌細胞H9c2凋亡，而EGCG可抑制H₂O₂介導的H9c2凋亡，用EGCG單獨處理H9c2時(shí)并未觀(guān)察到胞內外的H₂O₂水平的變化。

因此，本文解析EGCG氧化聚合的環(huán)境條件，及其穩定性變化對受試細胞氧化還原平衡的影響，為進(jìn)一步探討EGCG在細胞培養體系及活體中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常結腸上皮NCM460細胞購白中科院昆明動(dòng)物所細胞庫；EGCG粉末購白sigma公司；過(guò)氧化氫檢測試劑盒(S0038)購白上海碧云天公司。

MCO-5AC培養箱SANYO；318C酶標儀上海三科儀器；NanoPhotometerN60分光光度計IMPLEN；VANOX-S顯微鏡0TⅣPUS。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 主要試劑配制

1.2.1.1 EGCG溶液

0.15gEGCG粉末融人10mL的三蒸水中攪拌均勻配制成32mmol/L的EGCG溶液，在超凈T作臺利用0.2μm針頭濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。待實(shí)驗丌始前將EGCG溶液儲存液稀釋至如表1所需濃度。

1.2.1.2 細胞培養基

RPMll640或DMEM培養液Gibco，含10％胎牛血清Gibco；0.1％雙抗(10萬(wàn)單{立/mL)Gibco；1％L-谷氨酰胺(200mmol/L)Gibco。

1.2.1.3 其他

細胞磷酸緩沖液(PBS)Gibco；0.4％臺盼藍Solarbio，0.25％胰蛋白酶Gibco。

1.2.2 影響EGCG氧化聚合的環(huán)境因素分析

1.2.2.1 溶液環(huán)境對EGCG聚合的影響

實(shí)驗選擇了H₂O、RPMll640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養箱恒溫反應24h后，吸取三個(gè)重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溶液體系對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.2 溫度環(huán)境對EGCG聚合的影響

實(shí)驗以RPMll640(pH=7)為溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養箱和74℃的水浴鍋中恒溫反應24h后，吸取三個(gè)重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溫度對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.3 時(shí)間對EGCG聚合的影響

實(shí)驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，加入320μmol/L的EGCG，置于37℃培養箱恒溫反應3、6、12、24h后，各組吸取三個(gè)重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定時(shí)問(wèn)對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.4 pH對EGCG聚合的影響

實(shí)驗選用RPMI1640和H20為兩種溶液體系，分別設置不同的pH(pH=5和9)，加入不同濃度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分別置于37℃培養箱中恒溫處理24h后，各組吸取三個(gè)重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定pH對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.3 EGCG在培養系統中對NCM460細胞的胞內、外H₂0₂濃度影

響接種6個(gè)含NCM460的6孔培養板，待細胞貼壁生長(cháng)后，更換含有不同濃度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMll640培養液，每個(gè)6孔板培養時(shí)間分別為l、2、3、6、12、24h，在對應的時(shí)間節點(diǎn)先取各孔上層培養液50μL，用于胞外H₂0₂濃度檢測。之后，弁去含EGCG培養基，胰酶消化后用1mLRPMI1640培養基吹打混勻形成細胞懸液，計數，吸取5×105個(gè)細胞，用于胞內H₂0₂濃度檢測。

1.2.4 H₂0₂濃度檢測

按照過(guò)氧化氫檢測試劑盒操作步驟，檢測小同濃度EGCG處理各時(shí)間點(diǎn)的培養上清及細胞內H202濃度。

1.3 統計學(xué)分析

實(shí)驗均重復三次，對數據進(jìn)行整理歸納，利用SPSS17.0統計軟件進(jìn)行單兇素方差分析，采用GrahPadPrism5制圖軟件作圖分析。

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