一、分析意義

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎，它的含量是衡量農、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標，在育種、食品和飼料等工作中常常需要測定蛋白質(zhì)的含量。

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。全氨基酸和個(gè)別氨基酸的分析測定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。生物學(xué)及農業(yè)科學(xué)的許多領(lǐng)域都需要分析氨基酸。在評價(jià)谷物的蛋白質(zhì)營(yíng)養價(jià)值時(shí)需要測定游離氨基酸及蛋白質(zhì)的氨基酸組成。動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為兩種，即構成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸，另外，還有少量的由肽鍵連接的幾個(gè)氨基酸，以及與糖或脂結合在一起的。在人類(lèi)和動(dòng)物營(yíng)養學(xué)上，各種氨基酸含量的高低是很重要的，特別是有幾個(gè)限制性氨基酸，如稱(chēng)為“第一、第二限制氨基酸”的賴(lài)氨酸和色氨酸，是一種必需氨基酸，即必須從食物中直接吸收，而不能由人與動(dòng)物利用食物中的其它成分自身合成，卻又對人與動(dòng)物的生長(cháng)發(fā)育起著(zhù)重要作用的氨基酸;若缺乏這些氨基酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì )引起某些疾病，而這些氨基酸在貯存和加工的過(guò)程中極易損失破壞，因此它們的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標準之一。

二、蛋白質(zhì)的測定

（一）方法選擇的依據

蛋白質(zhì)的分析方法很多，可分為兩類(lèi)，一是利用蛋白質(zhì)中含有一定量的氮，通過(guò)測定樣品中的含氮量再乘以換算系數，計算出蛋白質(zhì)的含量，如開(kāi)氏法;另一類(lèi)是依據蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，測定蛋白質(zhì)的方法，如染料結合法雙縮脲法和螢光法等。最常用的方法是開(kāi)氏法，但開(kāi)氏法測定的氮中還包含有氨基酸、酸氨等非蛋白質(zhì)氮，由此而計算出的蛋白質(zhì)，故稱(chēng)“粗蛋白質(zhì)”，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱(chēng)為“純蛋白質(zhì)”。

開(kāi)氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，這個(gè)方法是丹麥人開(kāi)道爾于1883年用來(lái)研究蛋白質(zhì)變化的，后來(lái)被用于測定各種形態(tài)的有機氮。由于設備簡(jiǎn)單易得，結果可靠，為一般實(shí)驗室所采用。至今尚沒(méi)有別的方法能與其比擬或將其取代。因此國際谷物化學(xué)協(xié)會(huì )和美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì )以及我國等一些國家都把開(kāi)氏法作為標準的分析方法。但開(kāi)氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續較繁，分析的速度較慢，試劑費用較高。近年，已出現幾種以開(kāi)氏法原理為基礎的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開(kāi)氏定氮儀，如瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開(kāi)氏1030分析儀(Kjeltec Auto 1030 Analyzer);日本生產(chǎn)的Kjel-Auto自動(dòng)氮和蛋白質(zhì)分析僅和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel-FOSS自動(dòng)蛋白質(zhì)分析儀等，這些儀器雖然自動(dòng)化程度較高，但價(jià)錢(qián)昂貴，目前尚不能普及。

在生產(chǎn)和科研工作中，為了完成大批樣品的分析，需要采用快速、簡(jiǎn)易的分析方法，例如染料結合法、雙縮脲法、水合茚三酮法、亮磺化黃素螢光法、紅外光譜法，核磁共振法、以及測定開(kāi)氏消煮液中按的靛酚藍法和納氏比色法。根據一般實(shí)驗室的條件，這里側重介紹開(kāi)氏法和染料結合法。

（二）籽粒中粗蛋白質(zhì)的測定（開(kāi)氏法）

1、方法原理

氮是蛋白質(zhì)中的主要成分，同類(lèi)植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量基本上是固定不變的。因此，可用開(kāi)氏法消煮定氮，再將測得的含氮值乘以蛋白質(zhì)換算系數，即得粗蛋白質(zhì)含量。氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數，一般采用6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16%為根據導出的值，但不同植物籽位中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的因數也稍有不同。以定量蛋白質(zhì)為目的的總氮量測定中，開(kāi)氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類(lèi)特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，須要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開(kāi)氏法測定總氮量，同時(shí)用離子電極法測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數即得蛋白質(zhì)含量。

2、儀器及設備

消煮爐或電爐，消煮管100mL或50 mL，半微量定氮裝置，半微量滴定管。

3、試劑

（1）硫酸(H₂SO₄，p≈1.84 g·cm^-3，化學(xué)純);

（2）高錳酸鉀溶液［(KMnO₄)=50g·L^-1]:5g高錳酸鉀(KMn0₄，化學(xué)純)溶于水稀釋至100 mL;

（3）還原鐵粉(Fe，分析純);過(guò)100目篩;

（4）混合催化劑:硫酸鉀(K₂SO₄，化學(xué)純)、硫酸銅(CuSO₄·5H₂0，化學(xué)純)與硒粉(Se，化學(xué)純)100:10:1混合磨細;

（5）氫氧化鈉溶液〔c(NaOH)=10mol·L^-1]:400g氫氧化鈉(NaOH，化學(xué)純)溶于水，冷卻后稀釋至1L;

（6）硼酸溶液[p(H₃B0₃)=20g·L^-1]:20g硼酸(H₃80₃，化學(xué)純)溶于水，稀釋至1 L;

（7）混合指示劑:0.1g甲基紅0.5g溴甲酚綠溶于100 mL乙醇[ψ(CH₃CH₂OH)=95 %]中;

（8）鹽酸標準溶液[c(HC1=0.01mol·L^-1]:吸取濃HCI 8.3mL注入1L水中先配成(HC1)=0.1 mol·L^-1鹽酸溶液，用標準Na₂CO₃標定后(GB601-88),準確稀釋10倍。

4、操作步驟

（1）樣品的消煮：稱(chēng)取烘干樣品(過(guò)0.25mm篩子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL開(kāi)氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5 mL濃H₂S0₄，小心輕搖后(最好加塞放置過(guò)夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐或電爐上，開(kāi)始時(shí)用小火加熱，當消煮液呈棕色時(shí)，提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍色時(shí)，再加熱約10min，取下，冷卻至溫熱時(shí)，將消煮液無(wú)損地轉入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后，定容并放置澄清。

（2）氮的測定：用移液管吸取澄清待測液5.00 mL或10.00 mL放人半微量定氮儀中進(jìn)行定氮(以下操作同土壤全氮的測定)。同時(shí)作空白試驗，校正試劑和滴定誤差，并做核對試驗。

5、結果計算

粗蛋白質(zhì)%(干基)=(V-Vo) ×c×14×10^-3×分取倍數×k ×100÷m

式中:V——樣品測定所消耗鹽酸標準溶液的體積,mL;

Vo——空白試驗所有耗去鹽酸標準溶液的體積,mL;

10^-3——將mL換算成L的系數；

C——鹽酸標準溶液的濃度，mot·L;

14——氮的摩爾質(zhì)量，g·mol^-1;

10^-3——針mL換算成L的系數;

分取倍數——100/5或100/10;

M——樣品質(zhì)量，g，干基；

k——氮換算成蛋白質(zhì)的系數。

參考資料：土壤農業(yè)化學(xué)分析方法