6、注意事項

(1)本法測定的結果為粗蛋白質(zhì)的含量。如要測定純蛋白質(zhì)的含量，則樣品應先用蛋白質(zhì)沉淀劑如堿性硫酸銅、堿性乙酸鉛、單寧酸溶液［p(C₇₆H₅₂0₄₆)=200g·L^-1]、三氯乙酸溶液［p(C₂HC1₃0₂)=100g·L^-1〕等處理，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來(lái)，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數即可得“純蛋白質(zhì)”量。其具體步驟是:稱(chēng)取風(fēng)干磨細樣品0.5× × ×g～2.2×××g，放于150 mL燒杯中，加59 mL沸水，加熱至沸，5min后取下，放置30 min(如含淀粉多的樣品，則勿加熱至沸，而是加入50 mL沸水，再放入401～50℃水浴中保溫10 min即可，然后趁熱加入CuSO₄及NaOH溶液)。然后緩緩注入硫酸銅溶液〔p(CuSO₄)=60g·L^-1]25 mL，用玻棒攪拌，同時(shí)加入氫氧化鈉溶液[p(NaOH)=12.5g·L^-1]25mL，放置0.5h～1 h使沉淀完全(也可放置過(guò)夜)，用傾瀉法過(guò)濾，然后用沸水洗沉淀，至濾液遇BaCl₂溶液不產(chǎn)生白色BaSO₄沉淀為止，間接指示非蛋白質(zhì)含氮物已經(jīng)洗凈。將已洗凈的沉淀及濾器一起放入60 ^oC烘箱中烘至稍干即可。將已烘干的沉淀連帶濾紙，無(wú)損地轉入開(kāi)氏瓶中。

樣品的消煮：稱(chēng)取烘干樣品(過(guò)0.25mm篩子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL開(kāi)氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5 mL濃H₂S0₄，小心輕搖后(最好加塞放置過(guò)夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐或電爐上，開(kāi)始時(shí)用小火加熱，當消煮液呈棕色時(shí)，提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍色時(shí)，再加熱約10min，取下，冷卻至溫熱時(shí)，將消煮液無(wú)損地轉入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后，定容并放置澄清。

氮的測定：用移液管吸取澄清待測液5.00 mL或10.00 mL放入半微量定氮儀中進(jìn)行定氮(以下操作同土壤全氮的測定)。同時(shí)作空白試驗，校正試劑和滴定誤差，并做核對試驗。

（2）稱(chēng)樣量的大小取決于樣品的含氮量。若含氮為1%～5%，稱(chēng)樣量為0.30g，可根據含氮量的水平適當增減稱(chēng)樣量。

（3）在消煮過(guò)程中須經(jīng)常轉動(dòng)開(kāi)氏瓶，使噴淺在瓶壁上的樣品及早回流至硫酸溶液中。特別是開(kāi)始消煮后不久，會(huì )有大量氣泡上逸，升溫不宜過(guò)快，以防溢出。

（4）核對試驗是將已知量的NH₄⁺-N標準溶液〔如p（N)=100mg·L^-1NH₄⁺-N標準溶液10mL，其中含N lmg］放入半微量定氮蒸餾裝置中，按測定樣品同樣操作步驟進(jìn)行蒸餾、滴定，用以檢驗蒸餾過(guò)程中的誤差大小。

（三）同類(lèi)種子中蛋白質(zhì)的測定〔染料結合(DBC法)]

1、方法原理

蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴(lài)氨酸、精氛酸和組氨酸)的一NH₂、咪唑基和胍基，以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH2～pH3的酸性緩沖液體系中呈陽(yáng)離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類(lèi)物質(zhì)如桔黃G，酸性橙12^#等的陰離子結合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò )合物而沉淀下來(lái)，通過(guò)測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結合量，即每克樣品所結合的染料的毫克數。染料結合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中，蛋白質(zhì)的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關(guān)性。因此，可以用染料結合量來(lái)評比同種作物種子大量原始材料之間蛋白質(zhì)含量的高低。

如果要從染料結合量來(lái)計算樣品的粗蛋白質(zhì)的含量，則需要用開(kāi)氏法測定同類(lèi)種子的一批樣品的粗蛋白質(zhì)，同時(shí)也用染料結合法測定其染料結合量，然后求出粗蛋白質(zhì)對染料結合蛋的回歸方程或繪出回歸曲線(xiàn)。這樣，測定未知樣品的染料結合量，就可以從回歸方程計算或查回歸線(xiàn)得到粗蛋白質(zhì)了。若只需比較蛋白質(zhì)含量的高低(如在篩選同種作物種子的大批樣品時(shí))，則不必知道蛋白質(zhì)的絕對含量，而只要測定樣品的染料結合是即可進(jìn)行比較。

該法是間接測定種子中蛋白質(zhì)的方法，方法簡(jiǎn)單、快速，與開(kāi)氏法的相關(guān)性較好但準確性較差，適用于大批樣品的篩選工作。美國谷物化學(xué)協(xié)會(huì )將該法列為分析小麥蛋白質(zhì)含量的正式方法(AACC 11-2-72)?，F已有據此方法原理而設計的蛋白質(zhì)分析儀。但該法對隨意混合物的樣品不適用。

2、主要儀器

水平振蕩器;離心機;GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀或721型分光光度計。

3、試劑

染料溶液:稱(chēng)取檸檬酸(C₆H₈0₇. H₂O，分析純)20.70g和磷酸氫二鈉Na₂HP0₄. 12H₂0,分析純))1.44g溶于300mL～400mL水，全部轉入1000 mL容量瓶中。另外準確稱(chēng)取1.000g桔黃G (C₁₆H₁₀O₇S₂Na₂，分子量452.38)，加少量水在80^oC水浴上溶解。無(wú)損地轉入上述容量瓶中，再加入百里酚乙醇溶液〔p(C₁₀H₁₄)=100g·L^-1]3滴～5滴以防腐，定容。此溶液為1000 mg·L^-1染料溶液。

4、操作步驟

（1）標準曲線(xiàn)與樣品測定的同時(shí)，取1000mg·L^-1的染料溶液10mL、30mL、50mL、60mL、70mL、80mL放入100 mL容量瓶中，用水定容，即得濃度系列為100mg·L^-1、300mg·L^-1、500mg·L^-1、600mg·L^-1、700mg·L^-1、800mg·L^-1的染料標準溶液，可用GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀測透光率(T)，并用半對數座標紙繪制濃度一透光率(T)值的標準曲線(xiàn)，也可以把染料溶液用水稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482nm的波長(cháng)測定吸收值(A)繪制標準曲線(xiàn)。

（2）樣品的測定稱(chēng)取通過(guò)0.25mm篩子的谷物樣品0.2 g～0.7g(精確至0.001g),放入30mL試管中，加入1000g·L^-1染料溶液20 mL蓋緊試管口，在水平振蕩器上振蕩60min，使樣品和染料溶液充分反應，取反應后的渾濁液((8mL～10 mL即可)注入離心管中，以3000 r·min^-1的速度離心8min～12 min,至上部溶液沒(méi)清為止，以下操作步驟同標準曲線(xiàn)。

（3）回歸方程選取粗蛋白質(zhì)含量從低到高(如小麥種子粗蛋白質(zhì)含量可從7%～17%)的同一類(lèi)谷物樣品35個(gè)左右，用開(kāi)氏法測其粗蛋白質(zhì)，并用上述方法測定各樣品的染料結合量。根據所得的結果，計算出染料結合量與蛋白質(zhì)之間的回歸方程。從測得的未知樣品的染料結合量,求出蛋白質(zhì)的含量。

5、結果計算

樣品的染料結合量計算公式如下:

式中:B——每克樣品所結合的染料的毫克數mg·g^-1。

V——加入染料溶液的總體積mL;

10^-3——將mL換算成L的系數;

Co——染料溶液的初始濃度，mg·g^-1；

C——染料結合反應后殘余溶液中的染料濃度,mg ·g^-1;

m——樣品的質(zhì)量，g。

6、注意事項

（1）在偶氮磺酸染料中，除桔黃G外，也可以使用酸性12^#(Acid Orange 12^#，縮寫(xiě)AO₁₂,C₁₆H₁₁O₄N₂SNa，分子量 305.37)，它的分子結構與桔黃G基本相同，也含有一個(gè)偶氮發(fā)色基團，但只有一個(gè)磺酸基，即一個(gè)結合堿基的位置(桔黃G二個(gè))，后者每個(gè)堿基結合點(diǎn)引起的顏色變化約是枯黃G的兩倍。故其更適合于在染料結合法中應用，它們在482 nm左右有一個(gè)較寬的吸收峰，便于比色測定。

（2）樣品稱(chēng)樣量按蛋白質(zhì)含量的高低而定，水稻、小麥、大麥等樣品可稱(chēng)取0.5g，玉米稱(chēng)取0.7g，大豆稱(chēng)取0.2g，花生及魚(yú)粉等可少一些。

（3）染料結合反應的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應的時(shí)間和溫度等都會(huì )影響測定的結果，故每次測定應力求反應條件一致，特別是在測定樣品與測定回歸方程的樣品時(shí)，反應條件尤需一致。

參考資料：土壤農業(yè)化學(xué)分析方法