金銀花來(lái)源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThumb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效。歷代對金銀花的炮制方法主要有炒黃、炒炭、蜜炙等?！吨袊幍洹?015年版僅收載了金銀花，但山東、天津、上海、安徽、江西、廣東、廣西等省市炮制規范均收載了金銀花炭。金銀花炒炭后寒性減弱，并具有澀性和止血作用，善清解下焦及血分之熱毒。

現代研究表明，金銀花主要含有有機酸類(lèi)、黃酮類(lèi)等多種活性成分，有機酸類(lèi)成分主要有綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等，黃酮類(lèi)成分主要有槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、木犀草素等。綠原酸具有抗菌、解熱、抗炎作用，咖啡酸具有抗炎、止血作用，槲皮素可降低小鼠出凝血時(shí)間，木犀草素具有抗炎、止血作用。金銀花炒炭后綠原酸含量明顯降低，咖啡酸、槲皮素、木犀草素3種止血成分的含量顯著(zhù)增加。金銀花炭品混懸液、水煎液較其生品止血作用更顯著(zhù)，臨床多用于治療各科出血性疾病。但目前對金銀花炭止血作用的研究，多以正常動(dòng)物或體外實(shí)驗為主，止血機制尚不清楚。本實(shí)驗參閱文獻，從血熱出血模型大鼠的一般體征變化、體溫改變、凝血功能指標以及胃出血和損傷情況等方面，研究金銀花炒炭前后涼血止血作用變化。

1儀器與材料

1.1儀器

AYW8000半自動(dòng)凝血分析儀(南京瑞麥科技開(kāi)發(fā)有限公司)；H3-18KR型低溫冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司)；MK-30型電熱控溫炒藥機(江陰市祝塘明科機械廠(chǎng))；FA2004型電子天平(十萬(wàn)分之一，上海上平儀器有限公司)；D4-6050型真空干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2藥品與試劑

金銀花購自山東建聯(lián)嘉盛中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾。金銀花炭：按課題組前期優(yōu)選出的炒炭工藝制備。取凈金銀花，置電熱控溫炒藥機內(設定炒制溫度為250℃，炒制4min，炒藥機轉速為40r/min)，成品表面焦褐色，具焦香氣，得率80.78%。

云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號Z53020798)；干酵母(安琪酵母股份有限公司)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號F20170614)；枸櫞酸鈉(天國藥集團化學(xué)試劑，批號20170327)；其余化學(xué)試劑均為分析純。試劑盒：凝血酶原時(shí)間(PT，批號20171030)、凝血酶時(shí)間(TT，批號20171030)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT，批號20171030)，均購置于南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物

SD雄性大鼠，體重180～220g，購于濟南朋悅實(shí)驗動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物飼養許可證號：SCXK(魯)20140007。

2方法

2.1供試液的制備

2.1.1大鼠灌胃液的制備

稱(chēng)取金銀花炭粗粉300g、金銀花粗粉368.41g(按得率計算，相當于炒金銀花炭300g)，加10倍量水浸泡30min，回流提取30min，濾過(guò)；藥渣再加8倍量50%乙醇回流提取30min，濾過(guò)；藥渣再加乙醇回流提取30min，濾過(guò)；合并3次濾液，減壓濃縮成浸膏。取浸膏，加入0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，制成質(zhì)量濃度為0.60g/mL的大鼠灌胃液。

2.1.2干酵母混懸液的制備

取干酵母20g，加蒸餾水，研磨均勻，定容至100mL容量瓶中，制成濃度為20%的酵母混懸液，現用現配。

2.1.3云南白藥混懸液的制備

精密稱(chēng)取云南白藥粉末6.25g，研磨均勻，加入0.5%CMC-Na溶液配制成0.025g/mL的云南白藥混懸液。

2.2分組、造模及給藥

取SD雄性大鼠，置于溫度為18～25℃、相對濕度為45%～75%的動(dòng)物飼養房環(huán)境中適應性5天。分組前剔除不正常體溫(小于36.5℃或大于38.5℃)或連續兩次測體溫波動(dòng)大于0.5℃的大鼠，然后隨機分為5組，分別為空白組、模型組、云南白藥組、金銀花組、金銀花炭組，每組10只?？瞻捉M自由飲水，其余各組以5%乙醇代替自由飲水，連續7天。第8天開(kāi)始灌胃，給藥組分別灌胃給予金銀花生品與炭品灌胃液，空白組與模型組灌胃給予等體積的0.5%CMC-Na溶液，云南白藥組灌胃給予云南白藥混懸液(給藥劑量見(jiàn)表1)，每日2次，連續給藥7天，于第13天，空白對照組于背部?jì)蓚绕は伦⑸涞攘可睇}水，其余各組于背部?jì)蓚绕は伦⑸?0%的干酵母混懸液，注射劑量為10mL/kg。

2.3一般體征觀(guān)察

2.3.1大鼠體重增長(cháng)率測定

分別于實(shí)驗第7天和第14天，測定各組大鼠的體重并計算各組體重增長(cháng)率。

體重增長(cháng)率(%)=(第14天體重-第7天體重)/第7天體重×100%

2.3.2大鼠飲食量、飲水量測定

實(shí)驗第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液后，將各組大鼠的飲食量、飲水量進(jìn)行48h檢測，并計算各組大鼠每100g體重的飲食量和飲水量，取其平均值。

2.3.3大鼠糞便含水量測定

實(shí)驗第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液2h后，對各組每只大鼠取新鮮糞便1粒，稱(chēng)其濕重，置烘箱105℃干燥5h后，冷卻至恒重，稱(chēng)其干重，并計算糞便含水量，取其平均值。

糞便含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%

2.3.4大鼠肛溫測定

實(shí)驗第13天，大鼠皮下注射20%的干酵母混懸液后檢測各組大鼠的肛溫變化，每隔2h測1次，連續測定5次。

2.4大鼠血液內外源性凝血功能指標測定

實(shí)驗第14天，大鼠灌胃給藥1h后，將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3.8%枸櫞酸鈉1∶9(V∶V)抗凝，全血以3000r/min離心10min，取血漿，測定血漿內外源性凝血功能指標(PT、APTT、TT)。PT、APTT、TT各指標按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行測定。

2.5大鼠胃出血及損傷情況觀(guān)察

實(shí)驗第14天，大鼠取血后處死，剖腹取胃組織，用生理鹽水沖洗，浸于10%福爾馬林溶液中，肉眼觀(guān)察胃黏膜出血及損傷情況并拍照。

2.6實(shí)驗數據的統計學(xué)處理

采用SPSS22.0統計分析軟件對實(shí)驗數據進(jìn)行組間t檢驗及方差分析，實(shí)驗數據以x¯±s表示，P<0.05有統計學(xué)意義。

3結果

3.1金銀花炒炭前后對血熱出血模型大鼠體重增長(cháng)率、飲食量、飲水量、糞便含水量的影響

模型組組與空白對照組相比，大鼠體征發(fā)生了一系列變化，包括體重減輕，飲食量減少，飲水量增加，糞便含水量降低，大便顏色較黑，且干結顆粒變小，精神狀態(tài)較活躍，毛色干枯變黃，部分大鼠鼻內及耳蝸深處有出血現象。各給藥組與模型組比較，大鼠體重、飲食量均增加，飲水量減少，糞便含水量增加，大便稍軟，活動(dòng)量相對減少，毛色好轉，大鼠鼻內及耳蝸深處出血消失。記錄并分析各組大鼠給藥后一般體征變化。結果見(jiàn)表1。

3.2金銀花炒炭前后對血熱出血模型大鼠體溫的影響

大鼠背部?jì)蓚绕は伦⑸?0%的干酵母混懸液，并結合無(wú)水乙醇的化學(xué)刺激作用，可引起大鼠肛溫在第2h后明顯升高，與空白組相比，模型組大鼠發(fā)熱過(guò)程穩定，能8h維持高溫，說(shuō)明熱證模型復制成功。與模型組相比，陽(yáng)性組無(wú)明顯差別，表明云南白藥在大鼠體溫調節中樞中不起調節作用；金銀花組和金銀花炭組均能顯著(zhù)抑制酵母菌導致的大鼠體溫升高，但金銀花組優(yōu)于金銀花炭組，表明金銀花生品的涼血作用強于炭品。結果見(jiàn)表2。

4討論

中醫理論認為，血熱妄行出血是指熱邪侵入體內，致氣分熱、血分熱，血熱則郁結、互搏，血盛則瘀，則出血，為臨床常見(jiàn)疾病。本實(shí)驗采用5%乙醇長(cháng)時(shí)間化學(xué)刺激大鼠胃，導致大鼠胃粘膜灼燒制造出胃出血模型，并結合傳統的皮下注射干酵母混懸液制造出血熱模型，能夠避免采用乙醇造模法所致大鼠醉酒狀態(tài)，并且造模期間一直飲用5%乙醇，大鼠體內對乙醇有適應的過(guò)程，致使模型組大鼠和空白組大鼠的體內代謝成分有較大的差異，在這一點(diǎn)上選擇的血熱出血動(dòng)物模型更為合理。

本實(shí)驗采用干酵母結合乙醇建立大鼠血熱出血模型，探究金銀花生、炭品對血熱出血模型大鼠體重增長(cháng)率、飲食量、飲水量、糞便含水量、肛溫、PT、APTT、TT及其胃組織出血和損傷的影響。結果表明，金銀花和金銀花炭均能顯著(zhù)增加血熱出血模型大鼠體重和飲食量，降低模型大鼠飲水量、糞便含水量和直腸溫度，起到體溫中樞調節作用，其中，以生金銀花降溫作用更為顯著(zhù)；金銀花炭可明顯縮短血熱出血模型大鼠PT、APTT及TT，改善血熱出血模型大鼠胃出血和胃潰瘍情況，其作用顯著(zhù)強于金銀花生品。本研究結果表明，生金銀花涼血作用較強，止血作用較弱，炒炭后涼血作用減弱，止血作用增強。

PT反映外源性凝血系統，APTT反映內源性凝血系統，TT反映纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白、內外源共同性凝血系統是否存在抗凝和纖溶亢進(jìn)。金銀花炭可明顯縮短血熱出血模型大鼠PT、APTT及TT，說(shuō)明金銀花炭的止血機制可能是通過(guò)影響內外源性凝血系統起作用的。

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