1.3.6 生物膜系統產(chǎn)生工作能力的測量

參考KuSada等的方式 ，選用結晶紫染色法剖析蒜頭提取液對病菌生物膜系統產(chǎn)生工作能力的危害。將病菌細胞培養液按1∶1000的比率稀釋液，添加無(wú)菌檢測96填料中，添加不一樣含量的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL），30℃靜放塑造24h。清除細胞培養液，用無(wú)菌檢測雙蒸水清洗3次，無(wú)菌檢測風(fēng)干躁，添加200μL0.1%結晶紫上色液，室內溫度上色15mIn，無(wú)菌水清洗3次，添加1mL95%酒精浸洗生物膜系統，將洗劑于光波長(cháng)570nm處測量OD值。

參考PackIavaThｙ等的方式 ，運用激光共聚焦光學(xué)顯微鏡（cLSm）剖析病菌生物膜結構的轉變。將病菌細胞培養液按1%的占比連接含1mLLB培養基的24填料中，添加1.20mg/mL大蒜提取物和直徑為1cm的環(huán)形蓋玻片，靜放塑造24h。用無(wú)菌水輕輕地清洗裝片上未黏附的體細胞，0.1%吖啶橙上色1mIn。洗去不必要的上色液，將蓋玻片置顯微鏡下觀(guān)查。該光學(xué)顯微鏡配有激起光波長(cháng)為515～560nm的激起濾光器及60×（60倍）的油鏡，其光學(xué)顯微鏡相片與電鏡相片均由FluovIewv5.0手機軟件得到

1.3.7 基因的表達量的測量

選用即時(shí)熒光定量PcR（RT-PcR）技術(shù)性。病菌活性后添加1.20mg/mL大蒜提取物塑造24h，運用病菌RnA獲取檢測試劑盒獲取病菌RnA。在20μL反映系統中，添加10μL2×熒光定量PcR預混管理體系，0.4μL10μmol/L上、中下游引物設計，2μLcDnA模版。PcR增加程序流程為：預轉性95℃3mIn，轉性95℃7S，淬火57℃10S，拓寬72℃15S（45個(gè)循環(huán)系統）。相對性表述量（RQ）由2-ΔΔcT方式測算得到。

1.3.8 病菌腐壞工作能力的測量

參考Zhao等的辦法制取無(wú)菌檢測魚(yú)漿汁水。冷藏魚(yú)漿解除凍結后，按質(zhì)量比1∶1放水磨漿，加溫燒開(kāi)5mIn后靜放，制冷至室內溫度。用2層沙布過(guò)慮得魚(yú)漿汁水，添加1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-胱胺酸和40mg/LL甲硫氨酸，混和勻稱(chēng)后于121℃高壓滅菌15mIn，得無(wú)菌檢測魚(yú)漿汁水。無(wú)菌檢測情況下，在魚(yú)漿汁水中加入不一樣濃度值的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL）。將制作好的病菌菌懸浮液注射至無(wú)菌檢測魚(yú)漿汁水中，于30℃中搖床塑造48h，每間距6h抽樣，測量魚(yú)漿汁水中TVB-n和腐胺成分轉變 。

TVB-n的測量參考趙丹丹等的方式 ，取5mL試品，添加15mL0.6mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌，上清液用全自動(dòng)凱氏定氮儀測量。腐胺成分的測量參考Zhao等的方式 ，取2mL試品，添加25mL0.4mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌，上清液用丹磺酰氯衍化后用高效液相色譜色譜。

1.4 數據信息數據分析

應用SPSS21.0手機軟件和OrIgIn8.5手機軟件分析數據。測量結果以平均值±標準偏差（n≥3）表明，選用最少明顯差別法（LSD）開(kāi)展顯著(zhù)性差異剖析，顯著(zhù)性檢驗為5%。

2 結果與剖析

2.1 維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs信號分子的類(lèi)型

以根癌農桿菌為匯報菌，運用平行面劃線(xiàn)法剖析維氏氣單胞菌的AHLS分子結構造成狀況，結果見(jiàn)圖1。病菌形成的AHLS可根據瓊脂粉蔓延誘發(fā)根癌農桿菌造成β-半乳甘酶，并溶解底物X-gal造成深藍色黑色素。由圖1得知，維氏氣單胞菌可造成AHLS類(lèi)信號分子并誘發(fā)根癌農桿菌顯深藍色。

根癌農桿菌對不一樣碳鏈的長(cháng)度或含有不一樣官能團的AHLS分子結構比較敏感層度不一樣，這種AHLS經(jīng)TLc進(jìn)行，在培養液相對應的部位誘發(fā)根癌農桿菌展現深藍色色斑。依據色斑的比移值、樣子和色調深、淺可直接分辨AHLS的類(lèi)型及相對性成分。對維氏氣單胞菌的AHLS萃取液的TLc剖析結果見(jiàn)圖2。剖析得知，該病菌最少造成3種AHLS分子結構，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL與c6-HSL是現階段氣單胞菌屬報導數最多的2種AHLS信號分子。LI等在腐壞比目魚(yú)中分離出來(lái)的柔和氣單胞菌中檢查到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸?；?高絲氨酸內酯（c10-HSL）和n十二?；?高絲氨酸內酯（c12-HSL）。本實(shí)驗在維氏氣單胞菌中檢查到主鏈上的氧原子數量為質(zhì)數的AHL信號分子，即c7-HSL。

2.2 維氏氣單胞菌生長(cháng)發(fā)育歷程中AHLs活力轉變

病菌形成的AHLS分子結構濃度值受病菌相對密度轉變 危害，不一樣發(fā)育環(huán)節的病菌AHLS萃取液能誘發(fā)根癌農桿菌造成不一樣孔徑的深藍色圈。維氏氣單胞菌生長(cháng)發(fā)育歷程中的病菌數量與細胞培養液PH值的轉變 見(jiàn)圖3，AHLS活力轉變 見(jiàn)圖4。剖析得知，尿培養4h時(shí)處在多數成長(cháng)期前期，這時(shí)病菌代謝的AHLS可誘發(fā)根癌農桿菌顯深藍色。在4～10h病菌的迅速成長(cháng)環(huán)節，根癌農桿菌的掉色直徑持續擴大，表明AHLS的成分迅速積累。在10～18h時(shí)，根癌農桿菌深藍色圈的孔徑較大 ，這時(shí)細胞培養液中AHLS濃度值最大。在18～48h，病菌處在生長(cháng)發(fā)育穩定型，誘發(fā)匯報菌掉色的直徑減少，表明AHLS的濃度值逐漸減少。研究發(fā)現，AHLS成分的降低與自然環(huán)境PH值上升相關(guān)。AHLS的高絲氨酸內酯環(huán)在偏堿情況下構造不穩定，易解環(huán)。對病菌生長(cháng)發(fā)育歷程中細胞培養液的PH值轉變的分析表明：尿培養18h后細胞培養液的PH值由6.92升至8.11，塑造48h時(shí)PH值達8.97。伴隨著(zhù)病菌的生長(cháng)發(fā)育，細胞培養液的PH值持續上升，AHLS逐漸溶解，活力減少。

2.3 維氏氣單胞菌的遺傳基因剖析

革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌AHLS受體的人群磁感應系統軟件主要是由luxRI的同源基因管控。運用PcR技術(shù)指標分析維氏氣單胞菌中的luxRI同源基因，結果見(jiàn)圖5a。剖析發(fā)覺(jué)2個(gè)精彩片段編碼序列各自為基因表達管控因素AcuR和自誘發(fā)遺傳基因AcuI，這與ＪangId等的分析結果同樣，該專(zhuān)家學(xué)者初次在維氏氣單胞菌mTcc3249中檢查到AcuRI人群磁感應系統軟件。除此之外，剖析維氏氣單胞菌的碳水化合物脫羧酶遺傳基因和感病遺傳基因，結果見(jiàn)圖5b、5c。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶遺傳基因（ODC）和磷酸氫鈣脫羧酶遺傳基因（LDC）的驗出表明該病菌具備產(chǎn)腐胺和尸胺的工作能力，胞內酶遺傳基因（AhyB，ser，liP）的驗出表明該菌具備一定的胰蛋白酶活力和淀粉酶活力，微絨毛遺傳基因（flA）的驗出表明該菌具備微絨毛健身運動(dòng)和產(chǎn)生生物膜系統的工作能力。

2.4 大蒜提取物對維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs的抑制效果

大蒜提取物對維氏氣單胞菌的最少抗菌濃度值為2.5mg/mL（數據信息未表明）。本實(shí)驗挑選小于此濃度值的系列產(chǎn)品（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）來(lái)科學(xué)研究大蒜提取物對維氏氣單胞菌人群磁感應的影響功效。

根據檢驗微生物匯報菌根癌農桿菌的β-半乳糖苷酶促反應來(lái)剖析不一樣濃度值大蒜提取物對維氏氣單胞菌造成AHLS活力的影響功效，結果見(jiàn)圖6。剖析得知，伴隨著(zhù)大蒜提取物濃度值的提升（0～1.20mg/mL），根癌農桿菌的β-半乳糖苷酶促反應持續減少（P＜0.05）。這表明大蒜提取物對維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLS活力具備明顯的抑制效果（P＜0.05），且大蒜提取物的濃度值與其說(shuō)人群磁感應抑止活力呈顯著(zhù)量效關(guān)聯(lián)。大蒜提取物濃度值為1.20mg/mL時(shí)對根癌農桿菌的β-半乳甘酶活力的抑制率最大，為39.6%。這有可能是由于此濃度值下維氏氣單胞菌AcuR蛋白質(zhì)與人群磁感應抑止活性物質(zhì)的結合性最強，抑止了AHLS分子結構的基因表達表述。