(5)雜交瘤細胞塑造與抗原的分離出來(lái)取挑選出的呈陽(yáng)性雜交瘤體細胞在CO₂恒溫箱中開(kāi)展離體塑造，從細胞培養液中分離出來(lái)單抗?；虿捎肂ALB/c小白鼠或其等位基因小白鼠，首先用4-羥基十五烷或液體石蠟開(kāi)展腹部注入，1星期過(guò)后將雜交瘤細胞注射到小白鼠腹部中。注射1星期過(guò)后搜集小白鼠的肝腹水，分離出來(lái)肝腹水中的單抗。

3、抗原提純單抗的提純方式與多克隆抗體的提純方式相近?，F階段最有效的單抗的提純方式是免疫力親和力色譜分析，該法將鏈球菌A蛋白質(zhì)或抗小白鼠人免疫球蛋白與適度媒介(最常見(jiàn)的是Sepharose)化學(xué)交聯(lián)，制取免疫力親和力離子交換柱，將抗原融合后過(guò)柱，利用率可以達到90％之上。

(四)標識物的制取與提純

半抗原、抗原和抗體的標識依據選定的標識免疫力統計分析方法不一樣，采用不一樣的標識物。如酶聯(lián)免疫吸咐測定方法(ELISA)常見(jiàn)的標識物有辣根乳酸脫氫酶(horseradish Deroxidase，HRP)、偏堿磷酸酯酶(alkaline phosptlatase，AP)等，流動(dòng)性注入免疫力剖析(FIIA)常見(jiàn)的標識有魯米諾等，(ABS)系統軟件常用的標識物為生物素，金標免疫力剖析使用的標識物為納米金。

1、半抗原的標識與提純

半抗原的標識依標識物的類(lèi)別和半抗原的活力官能團不一樣使用不一樣標識方式。如用辣根乳酸脫氫酶標識含分散羥基的半抗原，一般 選用碳二亞胺法、活力酯法或混和酸酐法。用辣根乳酸脫氫酶標識帶有分散羥基的半抗原可選用戊二醛法、二異硫氰酸酯法等。必須特別注意的是，辣根乳酸脫氫酶催化反應氯丁二烯釋放出來(lái)臭氧，一些物理性質(zhì)不足平穩、非常容易被氧化的半抗原(如酚類(lèi)等)在與辣根乳酸脫氫酶共價(jià)鍵耦聯(lián)的歷程中需要留意遮光避氧，避免 半抗原被氧化后造成 相對應抗原無(wú)法識別。

酶標半抗原的提純可選用分析、超濾膜離心分離。小分子標記物標識的半抗原可選用薄層色譜、柱色譜分析分離純化。

2、抗原體的標識與提純

抗原體的標識視抗原體的類(lèi)別和性能而定。在化肥免疫力剖析中，常用的抗原體是人造的(半抗原與載體蛋白的耦聯(lián)物)，因而標識物能夠標識在人力抗原體的載體蛋白上。蛋白類(lèi)抗原體的標識、提純，與抗原的標識、提純方式相近。

3、抗原的標識與提純

抗原的標識依據標識物的差異使用不一樣的標注方式。辣根乳酸脫氫酶標識抗原常選用改進(jìn)的過(guò)碘酸鹽法，將要辣根乳酸脫氫酶分子結構中糖的醇羥基空氣氧化成醛基后與抗原的分散羥基共價(jià)鍵耦聯(lián)。分子結構中含分散羧基(如生物素等)、分散羥基的標識物(如辣根乳酸脫氫酶)與抗原的耦聯(lián)方式類(lèi)似含分散羧基、羥基的半抗原與載體蛋白的共價(jià)鍵耦聯(lián)。含脂環(huán)伯胺的標識物，選用重氮化法與抗原分子結構中色氨酸殘基的酚羥基鄰位產(chǎn)生甲酰胺鍵連接。含丙烯酸酯構造的標識物可與抗原的分散羥基立即耦聯(lián)。為避免 標識物耦聯(lián)在抗原的抗原體相接處而造成 抗原的病毒學(xué)活力減少，可選用馬來(lái)酰亞胺類(lèi)活力酯等辦法將標識物與多肽鏈抗原的巰基共價(jià)鍵聯(lián)接，由于抗原的抗原體相接處沒(méi)有巰基。納米金標識抗原則選用物理學(xué)粘附法。

因為標識物的分子大小不一樣，標識抗原的提純方式也不一樣。如標識物為小分子水化學(xué)物質(zhì)，標識抗原的提純可選用分析、離心式超濾膜法。若標識物為生物大分子(如辣根乳酸脫氫酶)，標識抗原的提純一般選用Sephadex疑膠柱色譜分析。如用小分子標記物標識半抗原，可選用薄層色譜、硅橡膠柱色譜分析分離純化。

(五)免疫力剖析新技術(shù)的確立與標準提升

1、抗原和抗體的濃度值挑選

抗原和抗體反映中，抗原的濃度值需與抗原體濃度值相一致，一般 選用矩陣測驗法挑選抗原和抗體的最佳濃度值組成。

(1)間接性市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法中被子原和抗原濃度值的挑選，針對問(wèn)接市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法，被子原和抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將被子原用pH 9.6的硫化物緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品，100μL/孔，被子酶標板不一樣的行，空白試驗孔加等容積緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

②封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150μL/孔，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將抗原用適度pH的聚磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer，PB)倍比稀釋液至一定濃度值系列產(chǎn)品添加酶標板的不一樣列，100μL/孔，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。

④加酶標二抗：將酶標二抗稀釋液至工作中濃度值，加至酶標板，100μL/TL，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。

⑤著(zhù)色測量：加底物與鉻黑T溶液100μL/孔，37℃下遮光反映15 min。加50μL/孔終止劑停止反映，在酶標儀上測量各孔的吸光度值。

各自以被子原濃度值和抗原濃度值為橫坐標軸、以吸光度數值縱軸做圖。挑選吸光度值約為1.0抗原和抗體濃度值都較低、處在吸光度曲線(xiàn)圖轉折點(diǎn)處的抗原和抗體濃度值為適宜濃度值組成。

(2)包被抗原立即市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法中被子原和酶標抗原濃度值的選取在包被抗原立即市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法中，被子原和酶標抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將被子原用pH 9.6的硫化物緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品，被子酶標板的不一樣行，100μL/TL，空白試驗孔加等容積緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

⑦封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150μL/TL，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將酶標抗原倍比稀釋液成工作中濃度值系列產(chǎn)品，加至酶標板的不一樣列，100μL/孔，37℃下反映1～1.5h。清洗除去分散物。

④著(zhù)色測量：加底物與鉻黑T溶液100μL/孔，37℃下遮光反映15min，加終止劑50μL/孔停止反映，在酶標儀上測量各孔的吸光度值。

各自以被子原濃度值和酶標抗原濃度值為橫坐標軸、以吸光度數值縱軸做圖。挑選吸光度值約為1.0處在吸光度曲線(xiàn)圖轉折點(diǎn)處的被子原和酶標抗原濃度值為適宜濃度值組成。

(3)被子抗原立即市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法中抗原和酶標半抗原濃度值的選取在被子抗原立即市場(chǎng)競爭酶聯(lián)免疫吸咐測定方法中，抗原和酶標半抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將抗原用適度pH的聚磷酸鹽緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品并被子酶標板的不一樣行，100μL/TL，空白試驗孔加等容積聚磷酸鹽緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

②封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150 μL/TL，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將酶標半抗原用磷酸緩沖溶液倍比稀釋液成一定濃度值系列產(chǎn)品并加至酶標板的不一樣列，100μL/TL，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。