2.3 資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換制取GABA的技術(shù)提升

2.3.1 溫度對資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換生產(chǎn)制造CABA的危害

酶法制取GABA是一個(gè)不可逆反應，適合的氣溫能夠使GABA轉換率做到較大，因此利用設定不一樣的酶轉換溫度來(lái)研究溫度對GABA轉換率的危害。以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加濕菌體(在55℃恒溫水浴鍋預備處理50min，改進(jìn)細胞的滲透性)30U/g，在150r/min的水浴搖床中開(kāi)展轉換，反映歷程中，操縱pH為5.0。溫度場(chǎng)設定為25、30、35、40、45、50℃，反映24h后停止反映并開(kāi)展燒開(kāi)解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過(guò)0.22μm有機濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開(kāi)展檢驗，結果見(jiàn)圖9。轉換率隨環(huán)境溫度上升慢慢提升 .當轉換溫度做到40℃時(shí)，GAD-0和GAD-PL轉換率做到最大，各自為64.78％和82.27％，再次上升溫度，轉換率反倒減少。這是由于枯草枯草芽孢菌植物細胞厚，而反映溫度過(guò)低時(shí)，底物與胞內酶液沒(méi)法充足觸碰促使轉換率低：當反映溫度過(guò)高時(shí)，酶與PLP可靠性差，進(jìn)而危害GABA的轉換率。

2.3.2 DH對資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換生產(chǎn)制造GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物.溶解雙蒸水中，添加預備處理過(guò)的濕菌體30U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床巾開(kāi)展轉換，反映歷程中，每過(guò)2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH調整pH，使其一直與原始pH保持一致。pH梯度方向設定為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反映24h后停止反映并開(kāi)展燒開(kāi)解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過(guò)0.22μm有機濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開(kāi)展檢驗。結果見(jiàn)圖10，當pH為4.5或5.0時(shí)，GABA轉換率最大，GAD-0的GABA轉換率為75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA轉換率為84.54％和84.21％。當DH低于4.5時(shí)，底物-水谷氨酸鈉在弱酸性情況下非常容易酸水解反應轉化成磷酸進(jìn)行析出，進(jìn)而產(chǎn)生奶白色混濁液態(tài).不利酶與底物的完全融合；當pH超過(guò)5.0時(shí)不利酶促反應巾心的磷酸氫鈣殘基以shifft-堿與PLP、底物融合，進(jìn)而抑止GABA的轉化成。由此可見(jiàn)，酶轉化法制取GABA的pH承受范疇窄，偏酸或過(guò)堿都不利酶促反應開(kāi)展，考慮到在高品質(zhì)濃度值底物下，過(guò)低的pH更非常容易造成 底物進(jìn)行析出，因此酶轉換適宜pH為5.0。

2.3.3 加菌量對資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換生產(chǎn)制造GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加預備處理過(guò)的不一樣濕菌體(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映24h，反映歷程中，操縱pH為5.0。反映完成后開(kāi)展燒開(kāi)解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液后用碳水化合物柱前衍化法開(kāi)展HPLC檢驗。結果見(jiàn)圖11，資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換率伴隨著(zhù)加菌量的提高而逐步提升，在其中GAD-PL和GAD-0分別在40U/g和50U/g時(shí)將底物徹底轉換，轉換率做到100％。GAD-PL的加菌量低于GAD-0是由于前面一種體細胞巾的PLP成分高過(guò)后面一種，PLP做為第二信使有益于酶促反應的開(kāi)展。
 

2.3.4 反應速度對資產(chǎn)重組茵全體細胞轉換生嚴GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加預備處理過(guò)的不一樣濕菌體，GAD-0和GAD-PL添加量分別為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映24h，反映歷程中，操縱DH為5.0。反映完成后開(kāi)展燒開(kāi)解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液完用HPLC-OPA柱前衍化法開(kāi)展檢驗，結果見(jiàn)圖12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL轉換生成GABA的生產(chǎn)量隨時(shí)隨地問(wèn)增加快速提升，在20h時(shí)轉換率做到100％，以后伴隨著(zhù)反映開(kāi)展，轉換率不會(huì )再產(chǎn)生變化。

2.3.5 底物濃度值對資產(chǎn)重組菌全體細胞轉換生嚴GABA的危害

以200g/L的磷酸為原始底物，溶解雙蒸水中，添加預備處理過(guò)的不一樣濕菌體，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映6h后，每過(guò)3h加補1.27g的磷酸共體至底物濃度值分別為200、250、300、350、400g/L，反映歷程中，操縱pH為5.0，反映48h。反映完成后開(kāi)展燒開(kāi)解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過(guò)0.22μm有機濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開(kāi)展檢驗。結果見(jiàn)圖13，當底物濃度值做到400g/L磷酸時(shí)，GAD-0和GAD-PL轉換生產(chǎn)制造GABA的轉換率各自從100％(底物濃度值350g/L磷酸)降低為97.72％和98.43％。綜合性考慮到，為提升 工業(yè)制造高效率和節約中下游分離純化成本費，挑選350g/L做為酶法制取GABA的適宜底物濃度值。

3 總結

創(chuàng )作者取得成功搭建并資產(chǎn)重組表述了帶有Escherichiacoli來(lái)源于的gadB遺傳基因的資產(chǎn)重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。試驗說(shuō)明在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程中加上0.5mmol/L輔酶磷酸激酶PL的GAD總酶活做到28.14U/mL，是對比總酶活的1.72倍。進(jìn)一步提升資產(chǎn)重組菌全體細胞酶法生產(chǎn)制造GABA的技術(shù)標準，結果顯示，當溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的適宜加菌量各自為50U/g和40U/g時(shí)，GABA轉換率做到100％。當磷酸濃度值為400g/L時(shí)，GABA生產(chǎn)量各自為275.60扎和273.61g/L?？偟膩?lái)說(shuō)，創(chuàng )作者調查了菌體發(fā)醇塑造操作過(guò)程中加上輔酶磷酸激酶PL對資產(chǎn)重組菌產(chǎn)GAD及制取GABA的危害，開(kāi)發(fā)設計了一種不用在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程和酶轉換管理體系巾加上價(jià)格昂貴輔酶PLP就能高效率生產(chǎn)制造GABA的T藝技術(shù)性，為GABA在食品類(lèi)和醫藥領(lǐng)域中的廣泛運用奠定了夯實(shí)基礎。