2 水環(huán)境治理中病原菌的無(wú)損檢測技術(shù)

近些年，水環(huán)境治理中病原菌的檢驗獲得了一定的研究成果，已從單一根據塑造法的傳統式病原菌檢驗方式發(fā)展趨勢至多種多樣生物學(xué)檢驗方式 ，這種技術(shù)性的發(fā)生和發(fā)展趨勢為病原菌檢驗帶來(lái)了新的構思。水環(huán)境治理中病原菌無(wú)損檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢見(jiàn)圖 1。

現階段最大多數的病原菌檢驗方式是塑造法和聚合酶 鏈 式 反 應 ( Polymerase Chain Ｒeaction， PCＲ) 。這 2 種方式在可選擇性和敏感度層面都很突顯，但塑造法比 PCＲ 法更用時(shí)。一些新起的方式如生物傳感器已經(jīng)研發(fā)中，其以后的發(fā)展趨向是達到成本低、高可選擇性規定。轉錄組測序因為擴散系數高和不必非特異引物設計等優(yōu)勢正逐步代替傳統式檢驗方式 ，但也存有差錯率高局限。近些年病原菌檢驗辦法的檢出限以及運用見(jiàn)表 2?，F階段，病原菌檢驗方式還存有類(lèi)似亞種無(wú)法區別、高致病及試品濃縮產(chǎn)生的抑止物等難題，這對新檢驗辦法的研發(fā)是很大挑戰。

2． 1 PCＲ 和即時(shí)定量分析 PCＲ PCＲ 是現階段病原菌檢測中運用最普遍的分子結構

分子生物學(xué)方式之一，其根據增加特殊的靶基因序列來(lái)進(jìn)行病原菌檢驗。關(guān)鍵根據轉性、淬火和拓寬( 淬火和拓寬還可以一起開(kāi)展) 3 個(gè)流程最后達到目標編碼序列的指數值變大。我國出入境簽證檢驗檢測國家標準( SN/T 1896—2007) 中選用 PCＲ 技術(shù)性對食物中的各種病原菌( 沙門(mén)菌、志賀氏菌、橙黃色鏈球菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增長(cháng)李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸滲出性腸子埃希氏菌 O157: H7、副血溶弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng )傷弧菌) 開(kāi)展迅速判定檢驗。

實(shí) 時(shí) 定 量 PCＲ ( quantitative real-time PCＲ， qPCＲ) 是在 PCＲ 技術(shù)性基本上運用瑩光數據信號值即時(shí)檢驗目的基因，根據內參或外參法對樣本中的特殊遺傳基因開(kāi)展定性分析，比基本 PCＲ 更加靈巧。已經(jīng)有大量的科學(xué)研究選用 qPCＲ 方式定量分析病原菌，如大腸桿菌和沙門(mén)菌 等。各自選用qPCＲ 方式與傳統式塑造法檢驗仙河鎮水質(zhì)采樣中大腸埃希菌和腸 球 菌，發(fā) 現 qPCＲ 方式的檢出限能做到1 CFU/100 mL，明顯好于傳統式塑造法?？墒?qPCＲ也存有 DNA 回收利用高效率低和對引物設計非特異規定高的難題。除此之外，qPCＲ 在檢測中還遭遇別的一些挑戰，如反映中存有 PCＲ 抑止物。即便 小量的PCＲ 抑止物也會(huì )延遲時(shí)間繁雜試品的閥值循環(huán)系統( Cq ) ，進(jìn)而造成 模版拷貝數比具體值低。為避免 假陰性結果的發(fā)生，可在 PCＲ 反映中添加對抑止物具備高靈敏的內部陽(yáng)性對照( 如內參基因) 開(kāi)展檢驗。除此之外，獲取全過(guò)程中殘存的抑止物如胍鹽和甲酸可選用 QuickDrop 和 NanoDrop 光度計檢驗，還可以根據凝膠電泳明確是不是有 ＲNA、DNA 及蛋白質(zhì)環(huán)境污染。假如試品中帶有蛋白質(zhì)等其它雜物的環(huán)境污染，能夠采用磁珠開(kāi)展核苷酸提純。此外，qPCＲ 無(wú)法識別活菌或死菌，會(huì )造成陽(yáng)性結果?，F階段，一般 采 用 疊 氮 溴 化 丙 錠 ( propidium monoazide， PMA) 對試品開(kāi)展前理，進(jìn)而防止陽(yáng)性結果的造成。PMA 是一種高寬比感光的 DNA 融合染劑，不可以通過(guò)完善的活細胞質(zhì)，卻能可選擇性地通過(guò)不詳細的死細胞質(zhì)。PMA 能與 DNA 融合產(chǎn)生不可逆化學(xué)鍵，抑止死細胞 DNA 的增加以做到區別死、體細胞的目地。

除此之外，PCＲ 與 qPCＲ 針對病原菌的大批量檢驗存有一定的局限。對于以上難題，多種 PCＲ、微滴 式 數 字 PCＲ 等技術(shù)性陸續造成。多 重 PCＲ ( multiplex PCＲ，mPCＲ) ，又被稱(chēng)為多種引物設計 PCＲ 或復合型 PCＲ，是在同一 PCＲ 反映管內與此同時(shí)再加上多種多樣非特異引 物 進(jìn) 行 PCＲ 擴 增。微 滴 式 數 字 PCＲ ( Droplet Digital PCＲ，ddPCＲ) 是第三代 PCＲ 技術(shù)性，歸屬于單分子結構剖析，可用以肯定定量分析。用 ddPCＲ 和 qPCＲ 記數江河自然環(huán)境中的沙門(mén)菌，發(fā)覺(jué)水里 ddPCＲ 的精確度和線(xiàn)形范疇與 qPCＲ 非常，但堆積物試樣中 ddPCＲ 的精確度和線(xiàn)形范疇顯著(zhù)高些。多種 PCＲ 和微滴式數據 PCＲ 技術(shù)性都解決了傳統式 PCＲ 方式高成本費、擴散系數比較有限、步驟繁雜、精準度劣等缺陷?？墒?mPCＲ 存有多總體目標增加標準不兼容的難題，ddPCＲ 檢驗濃度較高的試品時(shí)的線(xiàn)性顯著(zhù)降低。

2． 2 等溫擴增技術(shù)性

近些年新發(fā)展起來(lái)的等溫擴增技術(shù)性，不論是操作過(guò)程或是儀器設備規定層面都比 PCＲ 技術(shù)性更加簡(jiǎn)潔便捷，在臨床醫學(xué)和當場(chǎng)檢測中有著(zhù)優(yōu)良的市場(chǎng)前景，在其中，環(huán)受體等溫擴增( LAMP) 早已獲得一定的運用。該技術(shù)性是一種新式的核苷酸增加方式，其具體機理是應用 4 條非特異引物設計各自鑒別靶DNA的 6 個(gè)特殊地區，根據鏈置換反應完成等溫過(guò)程標準下遺傳基因的迅速增加。該辦法的特點(diǎn)是敏感度高( 檢出限比傳統式的 PCＲ 方式低 2 ～ 5 個(gè)量級) 、反應速度短( 30 ～ 60 min) 、臨床醫學(xué)應用不用獨特儀器設備和使用簡(jiǎn)易( 反映液、酶和模版的溶液放置 63 ℃ 上下恒溫水浴鍋或恒溫箱中 30 ～ 60 min) 。應用改性材料的 LAMP 定性分析地面中的大腸埃希菌和傷寒論沙門(mén)菌，敏感度采樣率為 0． 3 ～ 10 000 cells/mL，濃度較高的抑止物對定量分析結果危害較小，且 1 h 內可以進(jìn)行檢驗。LAMP 技術(shù)性根據 4 ～ 6 個(gè)引物設計的融合，因此比 qPCＲ 增加高效率低，也經(jīng)常因非特異性增加發(fā)生陽(yáng)性結果?，F階段較常用的避免 陽(yáng)性結果產(chǎn)生的辦法具體包含:

( 1) 應用特殊構造的PCＲ 管，該管內有一個(gè)穩定的小擋板將管分為 2 個(gè)地區，各自添加反映液和 DNA 染劑，但這些辦法提升了加液頻次，不適感用以大批檢驗;

( 2) 將染劑包埋在石臘中，反映完成后高溫熔融石臘從而釋放出來(lái)染劑，但該方式提升了前解決時(shí)間。