2.9 免疫力機構化學(xué)檢測:

組織芯片經(jīng)脫臘凝固、消滅內源過(guò)氧化氫酶、熱抗原修復和BSA封閉式后，Copine-3抗原1∶500稀釋液后滴邊加個(gè)集成ic，4℃孵育留宿。按GTVisionⅢ型免疫力組織化學(xué)診斷試劑盒表明實(shí)際操作，滴入HRP標識的高聚物(抗兔/鼠)室內溫度孵育40 min,DAB著(zhù)色2 min，蘇木素復染5 min，飲用水清洗10 min返藍，硫酸酒精分裂10 s，脫干全透明后封片顯微鏡下查驗。

結果

1．體細胞總RNA獲取及CPNE3基因擴增

如圖所示1所顯示，應用總RNA獲取檢測試劑盒獲取HBE的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理，數據顯示，3條RNA雜帶比較清楚、詳細，沒(méi)有顯著(zhù)彌漫、溶解狀況，說(shuō)明獲取的RNA品質(zhì)不錯。

應用任意引物設計將總RNA反轉錄為c DNA。以c DNA為模版，運用生成的CPNE3遺傳基因非特異引物設計開(kāi)展PCR擴增。PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理，發(fā)生與預估相對分子質(zhì)量尺寸一致的雜帶(約1600 bp)。

2．重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建及評定

重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3經(jīng)XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理后，在其中1條精彩片段(約1600 bp)與目的基因尺寸一致，另1條精彩片段(約5000 bp)與p EGFP-N1質(zhì)粒雙酶切后尺寸一致(圖2)。

對重組質(zhì)粒開(kāi)展DNA測序，結果經(jīng)分子伴侶序列比對搜索器(basic local alignment search tool,BLAST)核對，插進(jìn)精彩片段與目地遺傳基因編碼序列一致。說(shuō)明取得成功搭建了重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3。

3．瑩光倒置顯微鏡觀(guān)查

轉染體細胞48 h后，于瑩光倒置顯微鏡下觀(guān)查，各自轉染p EGFP-N1質(zhì)粒的對照實(shí)驗和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的對照組體細胞均有翠綠色瑩光。說(shuō)明質(zhì)粒轉染體細胞取得成功并表述EGFP(圖3)。

4．激光器掃描儀共焦顯微鏡觀(guān)查

p EGFP-N1質(zhì)粒轉染的293T和H1299體細胞中，EGFP在人體細胞內表述遍布勻稱(chēng);重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3轉染的體細胞，在激光器掃描儀共焦顯微鏡下能夠觀(guān)測到，翠綠色的Copine-3-EGFP與鮮紅色的GAPDH，及其深藍色的DAPI均有重疊，說(shuō)明Copine-3-EGFP融合蛋白定坐落于細胞核和細胞質(zhì)(圖4)。

5．顯微鏡觀(guān)查

各自搜集一切正常塑造的293T和H1299體細胞，按流程2.7實(shí)際操作，在添加抽提實(shí)驗試劑B解決前后左右各自抽樣經(jīng)結晶體紫上色后顯微鏡下觀(guān)查。添加抽提實(shí)驗試劑B前，細胞膜的結構詳細，可觀(guān)測到完全的體細胞;添加抽提實(shí)驗試劑B后，細胞質(zhì)在低滲透濃度標準下澎漲裂開(kāi)，詳細的細胞質(zhì)被提取(圖5)。說(shuō)明該辦法適用胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白的分離出來(lái)。

6. Western blotting檢驗Copine-3基因表達

各自獲取轉染p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的293T和H1299體細胞的胞質(zhì)蛋白質(zhì)和細胞質(zhì)胞核蛋白，開(kāi)展Western blotting檢驗。骨架蛋白β-actin和組蛋白Histon H一分別在胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白中被檢驗到;在胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白中都檢驗到Copine-3蛋白質(zhì)。說(shuō)明Copine-3蛋白質(zhì)在細胞核和細胞質(zhì)中都有表述(圖6)。

7．免疫力組織化學(xué)觀(guān)查

對肺癌機構臨床醫學(xué)試品開(kāi)展免疫力機構化學(xué)檢測，結果如圖所示7，箭頭符號所顯示，細胞核和細胞質(zhì)中都有深棕色著(zhù)色，Copine-3蛋白質(zhì)定坐落于體細胞質(zhì)和細胞質(zhì)。