2.4 PCI2細胞中的ROS水平及MDA含量

ROS主要來(lái)源于損傷的線(xiàn)粒體，當細胞內產(chǎn)生過(guò)量的ROS或體內氧化劑含量超過(guò)細胞的抗氧化應答能力時(shí)，細胞就會(huì )產(chǎn)生氧化應激。本試驗以DCFH-DA作為熒光探針，檢測2’，7’-二氯熒光素(DCF)的熒光強度即可獲知細胞內ROS的水平。與空白對照組相比，90μmol/LH202處理PCI2細胞4h后，細胞內ROS水平顯著(zhù)增加(P＜0.01)，達到460.43％(圖4a)，使細胞產(chǎn)生嚴重的氧化損傷；經(jīng)脂溶性提取物預處理后，能夠顯著(zhù)地抑制PCI2細胞內ROS的產(chǎn)生(P＜0.01)，其中2mg/L脂溶性提取物預處理細胞8h后，ROS含量為208.37％。熒光顯微鏡觀(guān)察染色后的PCI2細胞發(fā)現，細胞呈現的熒光強度變化與細胞內ROS水平變化趨勢一致(圖4b)。因此，脂溶性提取物可以有效地清除ROS，緩解H202引發(fā)的線(xiàn)粒體功能障礙。
 

當動(dòng)物或植物體產(chǎn)生氧化應激時(shí)，會(huì )發(fā)生脂質(zhì)氧化，而MDA是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，可以用來(lái)確定脂質(zhì)氧化水平。與空白對照組相比，90μmol/LH₂0₂處理PCI2細胞4h后，MDA含量顯著(zhù)增多(P＜0.01)，達到192.98％(圖5)；經(jīng)脂溶性提取物預處理8h后，能夠顯著(zhù)地阻止MDA的產(chǎn)生(P＜0.01)；而正常細胞經(jīng)脂溶性提取物處理后，在無(wú)H₂0₂傷害的情況下，其MDA含量可降低至25.71％。

2.5 脂溶性提取物對PCI2細胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制細胞凋亡，利用AnnexinV-FITC/PI進(jìn)行染色，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率(圖6a)。如圖6b所示，與空白對照組(8.14％)相比，H₂0₂處理顯著(zhù)增加了細胞凋亡率(23.66％)，經(jīng)朝鮮薊脂溶性提取物預處理后，PCI2細胞的凋亡得到顯著(zhù)抑制。其中，經(jīng)過(guò)2mg/L脂溶性提取物預保護后，細胞凋亡率降低至8.75％。

為了更加直觀(guān)地比較不同處理組的細胞凋亡情況，利用A0-EB對細胞進(jìn)行染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察細胞形態(tài)。如圖6c所示，空白對照組的細胞因為吖啶橙(A0)透過(guò)其完整的細胞膜嵌入DNA，幾乎全部呈現綠色熒光，細胞形態(tài)正常。沒(méi)有明顯的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變；經(jīng)H202處理的模型組的細胞發(fā)生了邊緣化、核凝集等發(fā)綠色熒光的早期凋亡現象，并且因為溴化乙錠(EB)透過(guò)其破損的細胞膜嵌入DNA，呈現出橘黃色熒光的晚期凋亡現象：而經(jīng)過(guò)朝鮮薊脂溶性提取物預處理的PCI2細胞呈現出早期凋亡和晚期凋亡細胞皆有減少的現象，并呈現質(zhì)量濃度依賴(lài)性。

3 結論

本試驗探究了朝鮮薊副產(chǎn)物中脂溶性提取物對PCI2神經(jīng)細胞的保護作用。利用GC-MS對朝鮮薊副產(chǎn)物中萜類(lèi)及甾醇類(lèi)化合物進(jìn)行定性與定量分析，結果表明，主要含有3種倍半萜內脂，2種甾醇及8種五環(huán)三萜。試驗以H202作為氧化損傷誘導劑，探究朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物的生理活性，發(fā)現該提取物可降低PCI2神經(jīng)細胞的氧化損傷，并且伴隨細胞內LDH漏出率、MDA含量及ROS水平的降低。經(jīng)過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染及A0-EB雙染后發(fā)現，經(jīng)脂溶性提取物處理的PCI2細胞凋亡率顯著(zhù)降低，與熒光顯微鏡的觀(guān)察結果一致。綜上，朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物對PCI2神經(jīng)細胞具有抗凋亡及保護作用，值得進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用與研究。